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ISSN : 1976-7447(Print)
ISSN : 2287-7363(Online)
Journal of Biomedical Research Vol.13 No.4 pp.282-286
DOI : https://doi.org/10.12729/jbr.2012.13.4.282

Gross lesions and histopathological findings after inoculation of Eimeria acervulina, E. maxima and E. tenella in broiler chicks

Cha Ho Jee*, Ah Young Kim
Laboratory of parasitology, Department of Veterinary Medicine, Chungbuk National University
(Received 12 Oct. 2012, Accepted 14 Dec. 2012)

Abstract

The aim of this experiment was to count excreted oocysts and to evaluate gross lesions and histopathological changes in broiler chicks infected with Eimeria; E. acervulina (Ea), E. maxima (Em), and E. tenella (Et). Twelve-day-old broiler chicks without infection with Eimeria spp. were used in this experiment. On day 12, the chicks in group Ea (n=3), Em (n=3), and Et (n=3) received oral inoculation with 5 × 103 sporulated oocysts of Ea, Em, and Et per 1 mL of tap water, while control chicks were injected with tap water of equal amount. The prepatent period (PP) for Ea, Em, and Et was four, five, and six days, respectively. To evaluate the progress of the coccidiosis, post-mortem analysis method and histopathological evaluation were performed two days after PP of Ea and Et, and three days after PP of Em at two-day intervals on one bird from each group. Intestinal segments (Ea, duodenum and upper intestine; Em, mid intestine; and, Et, cecum) of all chicks were obtained from the autopsied birds. Among pathological changes of coccidiosis, target parts of small intestine and caecal pouches showed mucosal petechiation and white plaques streaks in the duodenum. Histopathological evidence showed upper small intestinal villus preserved with different phases of parasite (zygotes, oocysts, macro- and micro-gametocytes) after infection with Ea in broiler chicks. Zygotes in the lamina propria and fusion of middle small intestinal villi in broilers infected with Em and invasion of the caecal crypt of oocysts and granulomatous inflammation of caecal submucosa in broilers infected with Et were found.

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Introduction

양계산업에 있어서 닭 콕시듐증은 가장 중요한 질병 중 하나이며 이로 인해 매년 막대한 경제적 손실이 초래된다[1]. 콕시듐증은 원충성 질병으로 닭에서 흔히 발견되는 중요한 세가지 콕시듐의 종류는 모래구포자충(E. acervulina), 맥시마구포자충(E. maxima) 그리고 닭 맹장구포자충(E. tenella)이다[2]. 이 질병은 계절에 따라, 혹은 감염된 종에 따라서 그 피해 규모가 다양하게 나타나며 흔히 나타나는 임상증상으로는 혈변, 사료 효율과 증체율의 감소, 활력 저하 등이 있다[3-4]. 그러므로 이 질병에 대한 효율적인 관리를 위하여 닭 구포자충 종을 분리하여 각각이 닭의 장관에 미치는 영향을 면밀히 검토할 필요가 있다. 구포자충 감염을 진단하기 위해 흔히 부검 시 육안병변을 관찰하거나 분변에서의 오오시스트의 배출량을 계산한다[1]. 그래서 본 연구에서도 육계 닭에서 분리한 각각의 모래구포자충, 맥시마구포자충, 그리고 맹장구포자충을 12일령 병아리에게 접종한 후 분변 내 오오시스트 배출량을 계산하고, 부검하여 육안병변과 조직의 병변을 관찰하고 병변지수(lesion score)를 0~4까지 5단계로 구분하여 구포자충 감염의 정도를 비교 연구하였다.

Materials and Methods

실험동물

 닭구포자충(Eimeria spp.)에 감염되지 않은 1일령 육계 10마리를 12일령까지 사육한 후, 4군으로 나누어 모래구포자충 접종구, 맥시마구포자충 접종구 그리고 맹장구포자충 접종구에 3마리씩, 대조구(Control)에는 1마리의 실험동물을 배치하였다. 사료나 음수는 무제한 급여하였다.

기생충

 모래구포자충, 맥시마구포자충 그리고 맹장구포자충의 오오시스트를 경상대학교 수의과대학 생화학실험실로부터 분양 받은 각각의 콕시듐 원충주를 닭에 경구접종 후 분변에서 오오시스트를 분리하여 증류수(DW) 1 mL 당 5 × 103 오오시스트가 되도록 보정하였다. 실험에 사용할 원충은 4°C 냉장고에 보관하였다가 2% 과망간산칼륨 용액에 30°C로 6일간 포자화시켜, 육계 한 마리당 5 × 103 오오시스트를 공격 접종하였다.

실험방법

 3마리씩 배치된 3시험구를 각각 모래구포자충(Ea), 맥시마구포자충(Em) 그리고 맹장구포자충(Et) 접종구로 그리고 나머지 대조구(C)를 무감염 대조구로 선정하여 실험하였다. 12일령에 Ea, Em 그리고 Et에 증류수 1 mL당 각각의 모래구포자충, 맥시마구포자충 그리고 맹장구포자충의 포자화된 오오시스트를 각각 5 × 103 씩, 구강으로 공격 접종하였으며, 대조구에는 1 mL의 증류수를 경구 투여하였다. 공격접종 1일 후부터 12일까지 분변 내 오오시스트의 수를 계측하였으며, 콕시듐증의 경과를 확인하기 위하여 Ea와 Et는 성숙전기(Prepatent Period; PP) 2일 후부터 2일 간격으로, Em은 성숙전기(PP) 3일 후부터 2일 간격으로 시험구당 1마리씩 부검하여 육안병변의 심각한 정도를 병변지수(lesion score)에 따라 0~4까지 5단계로 구분[5]하여 조사하고 Kawazoe 등[2], Ferando와 McCraw [6], Pattillo [7], Goodwin 등[1]이 기술한 내용을 토대로 조직 병리학적인 관찰을 수행하였다. 부검한 육계에서 획득한 장절편(Ea, 십이지장과 소장 상부; Em, 소장 중부; 그리고 Et, 맹장)은 조직의 병리학적인 소견을 관찰하기 위하여 10% 포르말린으로 고정 후 파라핀 포매된 조직을 4 μm 두께로 절편하여 haematoxylin&eosin (H&E) 염색을 하였다[8].

Results

모래구포자충, 맥시마구포자충 그리고 맹장구포자충의 오오시스트 동량(5 × 103)을 각 시험구 닭에 감염시킨 후, 분변 내 오오시스트의 배출량을 조사한 결과, 각각 다른 양상의 결과로 그림 1과 같았다(Fig. 1). 모래구포자충, 맥시마구포자충 접종구는 각각 감염 후 4일째와 5일째에 분변 내에서 처음 오오시스트가 관찰되었으며, 두 군 모두 감염 후 5일째 오오시스트의 배출량(oocysts per gram of feces; opg)이 가장 높은 수치로 4.2 × 105, 3.0 × 104로 각각 나타났었다. 모래구포자충 접종구에서는 오오시스트 배출량이 감염 후 10일까지, 맥시마구포자충 접종구는 감염 후 12일까지 관찰되었으며, 모래구포자충 접종구는 감염 후 6일째부터 오오시스트 배출량이 줄어드는 양상을 보였다. 맥시마구포자충 접종구는 감염 후 8일째 다시 opg가 3.0 × 104 값을 나타내고 그 뒤 12일째까지는 오오시스트 배출량이 점점 줄어드는 쌍봉형 분포 양상을 보였다. 반면에, 맹장구포자충 접종구는 감염 후 6일째 처음으로 오오시스트의 배출을 관찰할 수 있었으며(PP), 감염 후 7일과 10일에 각각 오오시스트 배출량이 2.8 × 105, 1.4 × 105으로 높은 값을 보였다.

Fig. 1. Oocysts shedding (opg) in brolilers infected with E. acervulina (Ea), E. maxima (Em) and E. tenella (Et).

 모래구포자충, 맥시마구포자충 그리고 맹장구포자충에 감염된 육계 닭에서의 감염 후 모래구포자충 접종구는 6, 8 그리고 10일째에 육안병변을 관찰했고, 맥시마구포자충 접종구와 맹장구포자충 접종구는 감염 후 8, 10, 12일째에 육안병변을 관찰하고 각각 병변 지수를 Johnson과 Reid [5]에 따라 0~4로 나타내었다(Table 1). 모래구포자충 접종구는 감염 후 10일째 육안병변이 가장 심각했으며 Johnson과 Reid [5]가 기술한 것과 같이 횡으로 늘어난 하얀 반점(plaques)이 유착되었으며 소장 벽이 두꺼워진 소견을 볼 수 있었다(Fig. 2). 맥시마구포자충 접종구는 감염 후 8일에 소장 점막의 점상출혈을 확연히 관찰할 수 있었으며 감염 후 12일에는 소장 점막의 충혈 소견을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 맹장구포자충 접종구는 분명하지 않은 점상출혈을 감염 후 10일과 12일에 관찰할 수 있었으며 맹장 벽의 비후는 관찰할 수 없었고 장 내용물도 정상으로 관찰 되었다.

Table 1. Pathogenic lesion score observed in broilers infected with E. acervulina (Ea), E. maxima (Em) and E. tenella (Et).

Fig. 2. Gross lesions of 10 days PI in broiler chicks infected with E. acervulina (Ea). (A) Petechial haemorrhage and white plaques of mucosa of duodenum (×1.0), (B) Gross lesion of upper small intestine (×5.6).

Fig. 3. Gross lesions of 8 and 12 days PI in broiler chicks infected with E. maxima (Em). (A) 8 days PI, mucosal petechiation of middle small intestine (×5.6), (B) 12 days PI, mucosal congestion of duodenum (×14).

 현미경상에서 닭 소장 점막조직을 관찰한 결과, 모래구포자충(Ea)에 감염된 닭의 상부소장 점막의 융모에 여러 단계(stages)의 콕시듐 발육단계(zygotes, oocysts, microgametocytes 그리고 macrogametocytes)를 관찰할 수 있었으며 융모의 위축과 융모 끝부분에서 응고괴사 소견을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 이러한 소견은 닭의 십이지장보다 상부 소장에서 더 분명하게 나타났으며, 구포자충 접종 후 6, 8, 10일을 비교하였을 때 시간이 지남에 따라 병변이 심해지는 것을 관찰할 수 있었다.

Fig. 4. Histopathological observations at 6 and 10 days after infection with E. acervulina (Ea) in broiler chicks. (A) 6 days PI, upper small intestinal villus preserved with different phases of parasite (zygotes, macrogametocytes, microgametocytes and oocytes) (×200), (B) 10 days PI, lesion of upper small intestinal submucosa with oocysts and zygotes (×200).

 맥시마구포자충(Em)에 감염된 닭의 중부 소장에서는 감염 후 8일에 융모의 점막 고유층에서의 접합체가 관찰되었으며 융모 위축, 그리고 다양한 콕시듐 발육단계(oocysts, microgametocytes와 zygotes)를 관찰할 수 있었다. 또한 접종 10일 후에는 융모의 융합과 융모 끝부분에서의 염증 소견이 관찰되었으며 접종 12일 후에는 상피세포의 증식소견이 확인되었다(Fig. 5).

Fig. 5. Histopathological observations at 6 and 10 days after infection with E. maxima (Em) in broiler chicks. (A) 8 days PI, zygotes in the lamina propria of middle small intestinal villi (×200), (B) 8 days PI, upper middle intestinal villus preserved with different phases of parasite (oocysts and microgametocytes) (×200), (C) 10 days PI, Fusion of villi (×100).

 맹장구포자충에 감염된 닭의 맹장에서는 콕시듐의 다양한 단계와 융모 위축, 염증소견과 육아종성 병변을 관찰할 수 있었고 기생충이 음와(crypt)에 침투하여 음와의 모양이 변형됨이 발견되었다. 점막하층이 매우 비후되고 다수의 임파구가 침윤된 것을 확인할 수 있었으며, 음와 내의 출혈 소견도 발견되었다(Fig. 6).

Fig. 6. Histopathological observations at 8 and 10 days after infection with E. tenella (Et) in broiler chicks. (A) 8 days PI, granulomatous inflammation in caecal submucosa (×40), (B) 8 days PI, oocysts in the caecal crypts and inflammatory process (×200), (C) ×200, (D) 10 days PI, stunted villi and infiltrated lymphocytes of caecal submucosa (×40).

Discussion

 육계 닭에 분리한 모래구포자충, 맥시마구포자충 그리고 맹장구포자충을 경구접종 후 분변 내 오오시스트의 배출량을 조사하고, 또한 부검하여 육안병변과 조직의 병변을 관찰 후, 그 결과를 비교해 보았을 때, Idris 등[9]과 Goodwin 등[1]이 기술한 바와 같이 분변 g 당 오오시스트 배설량, 육안병변 그리고 조직병변을 통해 유추해 볼 수 있는 병변의 심각도는 약간의 차이를 보였다. 분변 내 오오시스트의 배출량(opg)의 경우, 모래구포자충 접종구는 접종 후 5일에 분변 g 당 오오시스트 배설량이 최대값을 보이고 그 뒤로는 점점 감소하는 양상을 보인다. 반면에 접종 후 6, 8, 그리고 10일에서의 육안병변을 관찰할 때, 병변이 점점 더 심해지는 양상을 보이는 것을 확인 할 수 있다. 이는 조직 소견에서도 마찬가지였다. 맥시마구포자충 접종구의 경우, 분변 g 당 오오시스트 배설량은 접종 후 5일과 8일에 각각 높은 수치를 보이는 쌍봉형 분포를 보이는 반면, 육안적 소견은 접종 후 8일에 병변이 가장 심한 것을 확인할 수 있었고, 조직학적으로는 접종 후 10일에 병변이 가장 심했다. 맥시마구포자충 접종구의 분변 g 당 오오시스트 배설 량은 접종 후 7일과 10일에 가장 많은 오오시스트를 배출하는 쌍봉형 분포를 보였다. 이에 반해, 육안소견은 거의 발견할 수 없었고, 조직소견에서는 접종 후 8일과 10일에 심각한 병변 소견을 관찰할 수 있었다. 현미경을 통한 콕시듐감염 진단은 분변 g 당 오오시스트 배설 량이나 육안병변보다 민감도가 높았으며 보다 신뢰할 수 있음을 확인하였다. 조직병변을 통한 닭 콕시듐증 진단의 또 다른 장점은 단지 닭 콕시듐증을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 여러 발육단계의 콕시듐을 확인할 수 있으며 닭 소화기 질병의 다른 원인들까지 밝혀낼 수 있다는 점이다[1].

Acknowledgements

 본 연구는 2011년도 충북대학교 학술연구지원으로 수행된 연구 결과이며, 연구비 지원에 감사드립니다.

Reference

1.Goodwin MA, Brown J, Bounous DI. Use of microscopic lesion scores, gross lesion scores and oocyst count scores to detect Eimeria maxima in chickens. Avian Pathol 1998;27(4):405-408.
2.Kawazoe U, Bordin EL, de Lima CA, Dias LA. Characterisation and histopathological observations of a selected Brazilian precocious line of Eimeria acervulina. Vet Parasitol 2005;131(1-2):5-14.
3.Allen PC, Danforth HD, Augustine PC. Dietary modulation of avian coccidiosis. Int J Parasitol 1998;28(7):1131-1140.
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6.Fernando MA, McCraw BM. Mucosal morphology and cellular renewal in the intestine of chickens following a single infection of Eimeria acervulina. J Parasitol 1973;59(3):493-501.
7.Pattillo WH. Invasion of the cecal mucosa of the chicken by sporozoites of Eimeria tenella. J Parasitol 1959;45(3):253-258.
8.Ogbe AO, Atawodi SE, Abdu PA, Sannusi A, Itodo AE. Changes in weight gain, faecal oocyst count and packed cell volume of Eimeria tenella-infected broilers treated with a wild mushroom (Ganoderma lucidum) aqueous extract. J S Afr Vet Assoc 2009;80(2):97-102.
9.Idris AB, Bounous DI, Goodwin MA, Brown J, Krushinskie EA. Lack of correlation between microscopic lesion scores and gross lesion scores in commercially grown broilers examined for small intestinal Eimeria spp. coccidiosis. Avian Dis 1997;41(2):388-391.
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